Milana Vayntrub hizo su debut como actriz con una aparición especial en tres episodios de la serie de televisión de NBC ER en 1995. Junto con Stevie Nelson, cofundó el canal de comedia de YouTube Live Prude Girls, donde produjeron numerosos sketches cómicos cortos. Live Prude Girls ganó reconocimiento y apareció en la lista de los 100 mejores canales de NewMediaRockstars, asegurando el puesto 93. A lo largo de su carrera, Vayntrub ha asumido pequeños papeles tanto en cine como en televisión, incluidas apariciones en proyectos como Life Happens y Silicon Valley. También ha aparecido en varios videos de comedia en CollegeHumor.
De 2013 a 2016, Vayntrub interpretó el papel de Lily Adams, una vendedora, en una serie de comerciales de televisión para AT&T, repitiendo el papel en 2020. Además, interpretó a Tina Shukshin como una serie regular en la serie de Yahoo! Screen Other Space en 2015, creada por Paul Feig. Al año siguiente, apareció en el reinicio de Los Cazafantasmas de Feig junto a los miembros del elenco de Other Space, Neil Casey, Eugene Cordero, Bess Rous y Karan Soni.
Entre 2016 y 2017, Vayntrub apareció en la serie de televisión This Is Us, interpretando al personaje de Sloane Sandburg. En julio de 2017, fue elegida para el papel principal de la superheroína de Marvel Comics, Squirrel Girl, en el piloto de televisión New Warriors para Freeform. Sin embargo, la serie no avanzó y, a pesar de los esfuerzos por encontrar otra cadena, finalmente se canceló. A pesar de este revés, Vayntrub prestó su voz a Squirrel Girl en la franquicia Marvel Rising y protagonizó un podcast con guión de seis episodios de Marvel y Sirius XM titulado Marvel’s Squirrel Girl: The Unbeatable Radio Show. También en 2017, Vayntrub protagonizó la serie de televisión interactiva en streaming de Eko That Moment When como Jill.